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第一章前言
 
1.1 概论
橡胶树(Hevea brasiliensis),又名三叶橡胶树、巴西橡胶树,属大戟科(Euphobiaceae)橡胶树属(三叶橡胶树属,Hevea)植物,原产于巴西亚马逊河流域,现在亚洲、非洲、大洋洲、拉丁美洲40多个国家和地区商业种植。我国成为继泰国、印度尼西亚、马来西亚、印度等国之后的产胶大国,产量位居世界第五位,受气候条件所限,橡胶树种植主要分布在海南、云南、广东等省区。
天然橡胶是植胶区农民的最主要收入来源,是我国热带地区重要的农业支柱产业,随着经济的迅速增长,我国对天然橡胶需求量将大幅增加,供需缺口在逐年加大,自给率逐年降低。天然橡胶产业在我国属于典型的资源约束型产业,受气候条件的制约(Shafar Jefri Mokhatar et al., 2011; JUN-WENCHEN et al., 2011; M.K.V.CARR, 2011),产品具有明显的地域性、不可代替性,在国民经济建设和国家安全建设中具有重要的地位。
橡胶树优良品种是产业发展的基础,新品种选育以常规育种为主。通过常规育种培育一个品种的周期长达30年以上,超长育种周期严重阻碍了巴西橡胶树的改良和品种更新的进程。栽培品种狭窄的遗传基础也明显制约育种工作的进程,占世界植胶面积90%以上的东南亚地区,其商业规模种植的材料起源都可追溯到英国人魏克汉引种到新加坡等地的几十株原始实生苗。半个多世纪的人工定向选育种工作取得了显著的成就,橡胶树的干胶产量有了很大程度的提高,然而由于长期以来近缘杂交育种,造成了遗传基础日趋狭窄,使目前的选育种工作出现了停滞局面,育成新品种增产幅度不大,同时在各植胶国,橡胶树的病虫害频繁发生,危害程度也有逐渐加重的趋势,已成为世界橡胶产业面临的一个严重问题。
随着分子生物学和基因组学的快速发展,特别是分子标记应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、种质资源鉴定和QTL定位分析研究,为橡胶树育种中的亲本选择和分子标记辅助育种提供了新思路和光明前景。
 
1.2 橡胶树早期评价及其遗传标记
1.2.1亲本组合选配早期评价
橡胶树育种工作开始于上世纪初的马来西亚等植胶国,首先从大量实生树群体中选出初生代无性系,以初生代无性系为亲本,展开了橡胶树人工授粉选育种工作。经多年实践,在杂交亲本的选配上确定了以下基本原则:
1、亲本需优点多,而且主要性状突出,缺点又较易克服,双亲主要性状的优缺点要能互相弥补。一般来说,亲本优点较多时,其后代性状表现的总趋势将会较好,出现优良类型的机会将会增多。关于双亲的优缺点互补,是指亲本一方的优点应在很大程度上克服对方的缺点。这样,对数量遗传的性状来说,会增大杂种后代的平均值,对于质量遗传的性状来说,后代可出现亲本一方所具有的优良性状。
2、选用当地推广品种作为亲本之一。这是因为当地推广品种曾在本地较长时间栽培,对当地自然条件和栽培条件有一定的适应性。用这样的品种作为亲本之一,就能使杂种子代对当地的自然和栽培条件有较强的适应性。
3、选用生态类型差异较大,亲缘关系较远的品种作亲本。一般来说,不同生态类型、不同地理起源和亲缘较远的品种,具有不同的遗传基础,其杂种后代会出现更多的变异类型和超过双亲的有利性状。同时由于双亲是在不同生态条件下产生的,有利于选出适应性较好的新品种。
4、选择一般配合力好的品种作亲本。所谓配合力是指某一亲本品种与其它若干品种杂交后,杂种后代在某个性状上表现的平均值。用配合力好的品种作亲本,杂种子代往往较好,容易选出好品种。亲本配合力好坏,需要杂交以后才能测知。
育种亲本的选择应在遗传理论指导下,以获得目标性状最大遗传增益为目的,巴西橡胶树的产胶遗传性是受微效多基因控制的数量性状,因此以高产为育种目标必须接受数量遗传学的指导(刘乃见,1980)。亲本表型值的观测包括环境效应和遗传效应,其中遗传效应又可分为加性效应和非加性效应,育种工作者最关心的则是加性效应(即亲本的一般配合力或称育种值)这个遗传参数。关于这方面理论国外学者做了大量的研究(Dijkman1951Shepherd1969Wycherley1969Tan1987Simmonds1989 Cl´ement-Demange et al2000Priyadarshan2003aPriyadarshan and Cl´ement-Demange2004)。大量初生代无性系(指从未知亲本实生树群体中选择优株建立的无性系)的选育使橡胶树的干胶产量得到了大幅度的提高,如马来西亚的PilA44PilB84 PilB16PB23PB25PB86PB186Gl1等。无性系的推广应用,橡胶树优良的性状可得到稳定的遗传,因此橡胶树的育种重心也从初生代的选择向优良无性系间的杂交偏移。通过将一般配合力高的无性系混合种植,使其产生大量的子代,在这个过程中基因的重组产生高的遗传性状分离,再通过一定的程序在自然杂交的子代中选择产量和副性状均优良的个体,从而实现品种的改良(Tan et al. 1996)。20世纪50年代,随着人工授粉技术应用于橡胶树选育,通过控制授粉子代的遗传测定估算亲本的一般遗传力,使优良亲本的选择更加准确。同时,随着分子生物技术的飞速发展,DNA指纹图谱技术可从分子的水平上分析亲本与子代间的多样性,也可为亲本的选择提供参考。根据选育目标确定授粉亲本,通过人工控制授粉形式让其基因重组,杂交授粉子代经过有性系评估试验、小面积无性系试验和大面积无性系试验三个阶段,选育出来的优良无性系使产量比初生代无性系又有了一个大幅度的提升,在马来西亚RRIM系列无性系的选育使干胶产量从500kg/ha提高到2,500kg/ha。在这个过程中,一些初生代无性系间特定组合被认定为选育早熟品种的最优组合,即亲本的特殊配合力较高。至少有16个初生代无性系对现阶段无性系的培育有着重要的贡献,成为祖先亲本,如PB56PB24PB23PB25Tjir1Gl1PB86PB49PR107Mil3/2Hil29AVROS255RRIC52PilB50PilB84GT1Wycherley,1976)。各国通过初生代无性系、次生代无性系(指以初生代无性系为亲本的杂交后代选育出来的无性系)及三生代无性系(指以次生代无性系为亲本的杂交后代选育出来的无性系)等优良无性系间的杂交,在干胶产量、木材产量及副性状上对橡胶树进行改良,均取得了优异的成果。目前,马来西亚从早期的初生代品种的选育到后来杂交品种的培育,一直走在世界的前列,其培育的RRIM600无性系在多个植胶国被大面积推广应用,对产业的发展起到了推动的作用。近年开始侧重胶木兼优品种的选育,并取得了重大的进展。现阶段该国主要推广品种有:PB280PB366PB260RRIM901RRIM937RRIM938RRIM908RRIM936RRIM2023RRIM2024RRIM3001(Shafar Jefri Mokhatar, et al., 2011)等;泰国目前推广品种:RRIT250RRIT251RRIT226songkhla36等品种;越南主要推广品种:RRIVZRRIV4RRIV200系列等;印度推广的品种:RRII105RRll228等;斯里来卡的主要推广品种:RRIC100RRIC102 RRIC121 RRIC130等;印度尼西亚的主推品种:BPM24BPM107IRR5等,另外IRR100组和IRR200组中个别优良的无性系也完成系统鉴定,进入试种推广阶段。
我国橡胶树种植及育种工作均起步较晚。1904年引种种植,1956年前后进行橡胶树品种的选育工作。我国主要植胶区均属于热带北缘,受台风和低温两大自然因素制约,引种驯化的基础上再通过优良品种间杂交是选育最基本的策略。50年代中期(周钟毓1989)确定橡胶树的良种繁育和推广分两阶段进行:1955-1959年推广由优良母树枝条繁殖成的国内无性系;1960-1965年推广较高级的良种,即国内推广级以上的无性系和引进的国外优良无性系。PB86RRIM600PR107GT1等国外优良无性系在云南、广东和海南垦区被大面积试种并取得成功,此项举措为我国橡胶树选育种提供了宝贵的亲本资源(吴云通等,1993)。因此早期的杂交育种的亲本也以这些品种为主,也包括从早期的试种胶园中选择的优良母树无性系和其它小规模推广级别的国外品种,PR107RRIM600、PB86、GT1等4个品种作为亲本的重复使用,成为我国橡胶树育种中重要的祖先亲本
因我国各植胶区的环境特征相差很大,只能根据各自的环境特点选择适合的亲本进行杂交授粉工作,海南省的主要限制因子为台风,选育种的目标即为高产和高产抗风为主,以抗风能力较强品种PR107为父本,高产品种RRIM600为母本,选育出了保亭155、保亭235、热研7-33-97、热研7-20-59、大丰78-14和大丰78-25等一批高产抗风品种;以PB86PR107为亲本,选育了大丰95、大丰99、保亭3418和保亭911等优良无性系;以PB5/51PR107为亲本,文昌193、文昌215及文昌217等无性系的选育;同时,利用早期引种驯化的初生代无性系海垦1为亲本,与RRIM600PR107杂交,选育出保亭933、保亭936及文昌217等优良无性系。
广东省植胶区受台风和低温两个环境因子的影响,抗逆品种的选育为重点,抗寒品种93-114、南华1、广西6-68及天任31-45,抗风品种PR107和海垦1为育种亲本的首选,以这些品种为亲本,该地区成功选育了湛试327-4、湛试327-13、湛试167-16、湛试8-67-3等一批优良无性系应用于生产。
云南植胶区主要受低温寒害影响,抗寒品种GT1较好的结实率和可授性成为该地区最主要的亲本材料之一,广西6-68具有较强的抗辐射型寒害的能力,也是育种亲本的较理想选择。GT1PR107被认为具有较好的一般遗传力,将两个品种混合种植,让其自然杂交,收集自然果进行再进行鉴定,也是该地区品种选育的另一个重要途径。经过几十年的努力,该地区成功选育了云研277-5、云研73-46、云研73-477、云研74-625和云研75-1等无性系。从GT1PR107的自然授粉果中选育出大规模推广品种云研77-2和云研77-4,目前这两个品种已成为该植胶区的主推品种,广东垦区也进行了规模的引种试种试验。
广西植胶区低温寒害较重,同样也为抗寒品种的筛选提供了条件,该地区在大量实生树中筛选出了选育出具有抗辐射低温和平流低温较强的五星I3,中抗的桂研63-14、红山Ⅱ26,以及亭亮原8、亭亮291及亭亮62-5等无性后代。以这些无性系为材料开展了有性杂交工作,经过多年的比较鉴定,筛选出了具有较强的抗寒性且较稳定桂研73-165和桂研81-8两个品系(罗庆新,1988)。因种种原因,广西省植胶面积大幅缩减,橡胶研究所也不再将橡胶作为研究的主要作物,但该地区开展的研究工作为橡胶树的抗寒选育种积累了宝贵的经验,提供了优异的资源,并在亲本选配和育种策略上提出“有性-无性交替抗寒育种的方法,能够逐代提高抗寒品系的抗寒力和产量水平,并且注重原产地抗寒种质资源的引进”(徐其兴,1984)。我国自主培育的栽培品种在广东、广西、云南、海南等植胶区大面积的推广种植,推动了热区产业的发展,取得了巨大的社会、经济和生态效益。
少数亲本的重复利用,致使现有栽培种的遗传基础狭窄,育种工作者已重视各国育种资源的交流及对橡胶树野生种质资源的收集、鉴定和利用。
1.2.2杂交子代早期评价的遗传标记
遗传标记是指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性,是基因型的特殊的易于识别的表现形式。多用于研究物种起源、系统进化及经济性状的相关性;分析群体间遗传结构;预测杂种优势和进行标记辅助选择等。其种类包括:形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记等(贾继增, 1996)。自从19世纪中期,奥地利学者孟德尔首创了将形态学性状作为遗传标记的应用先例以来,遗传标记得到发展和丰富。形态学标记、细胞学标记、生化标记、免疫学标记等一直被广泛应用,然而这些标记都无法直接反映遗传物质的特征,仅是遗传物质的间接反映,且易受环境的影响,因此具有很大的局限性。DNA作为遗传物质载体,是研究动物遗传特性的一个重要指标。20世纪80年代以来,随着分子生物学技术分子遗传学的迅速发展,分子克隆DNA重组技术的日趋完善,研究者对基因结构和功能研究的进一步深入,在分子水平上寻找DNA的多态性,以此为标记进行各种遗传分析DNA分子标记直接反映DNA水平上的遗传变异,能稳定遗传,信息量大,可靠性高,消除了环境影响。DNA水平的遗传标记自产生以来得到广泛应用。
在橡胶树育种过程中,任何一个优良品系的产生,一般均须通过有性杂交的方式,在选出的亲本母树(或品系)间杂交,双亲本的基因重组,使其遗传性发生改变,并通过后代的培育与利用选育出适合人们需要的新品种。由于杂种后代性状会出现分离,因此,有必要对杂种第一代的产量、抗性及其它性状进行测定,从中选出最优个体进行繁殖利用。由于橡胶树的生产周期较长,选育出一个优良的品种至少需要30年的时间,为缩短育种年限,加速橡胶树选育种的进程,国内外在橡胶树苗期的产量和抗性的预测方面展开了大量的研究(何康等,1987;黄华孙,2005;周钟毓等,2000)。通过CramerHammakerMorrisMann等人的研究,发展了苗圃选择技术,以鉴定幼龄实生树群体中具有高产潜力的植株。N.wSimmonds认为,预测的目的是通过预测选出尽可能多的优良单株,淘汰部分低劣的基因型,最大限度地提高群选样树中优良单株的比例。Frey强调指出:植物育种工作中最艰巨的任务,在于建立检定和利用新采集的材料中合用的种质方法。这就道明早期预测方法在育种工作中的重要性。Ong Seng Huat认为:一种可靠的早期选择方法,由于在试验早期减少了杂交组合的子代群体和缩短了世代周期,对土地和所花的精力来讲也会是经济的(周钟毓等,2000)。
前人研究并逐步发展完善出了形态、细胞、生化、分子标记等遗传标记,并广泛运用在橡胶树良种培育方面,大幅缩短了杂优子代的筛选时间,提高了优株选择的准确率,为橡胶树选育种提供了众多宝贵的亲本材料或中间材料。
 
1.2.2.1  形态标记
19世纪中期,第一次将豌豆形态性状作为遗传标记的奥地利学者孟德尔在其著名豌豆杂交试验中发现了分离规律和独立分配规律。摩尔根则对果蝇6个形态性状的分析后,构建了第一张遗传连锁图。Sturtevant成功地定位了5个基因在果蝇的X染色体上,并以此确立遗传作图基本原理和遗传学的染色体理论。之后,水稻、玉米、大豆、小麦等多种农作物广泛利用形态标记在遗传作图、连锁分析和基因定位等领域(O'Brien S J, 1993)。形态学标记研究物种是基于个体性状的描述,虽然得到的结论往往数量过少、可鉴别标记基因有限、不够完善,以及容易受到环境等因素的影响,尤其需要使用生物统计学知识进行分析,但形态标记在研究质量性状的遗传方面显得直观、简单和方便,大多数育种家仍在选用并发挥其应有作用。
在橡胶树领域,在上世纪五六十年代主要发展出了“叶脉胶”、“小叶柄胶”、“试割法”等一系列标记。1959年,马来西亚橡胶研究院意识到大群体的苗圃有性系对于取得选择效果的重要性,因而此后增加了每个组合人工授粉的数量。1961年根据人工授粉苗的生势进行了第1次苗圃选择;1938Cramer发明了一种特制的小刀,在12~18个月龄的植株茎干上作切口,以便对幼龄胶树进行产量分级,这种方法称为刺检法;MorrisManr发明了另一种检验法,即对2-3龄树连续割胶的试割法。我国在50年代中期就应用刺检和试割法进行预测,效果不佳。60年代中期开展形态预测,由于形态指标多,易受环境和人为的干扰和影响,同时又不能数量化,局限于个人和本地的经验,因此,准确性也不理想。70年代中期在形态预测的基础上,在叶片上寻找预测指标,提出叶脉胶预测法,接着又提出能够数量化,有一定精度的小叶柄胶预测法。周钟毓等比较了1-86种产量早期预测方法对未知产量橡胶树人工授粉苗(树)产量预测的准确度。结果表明:“小叶柄胶”准确率最高。“叶脉胶法”、“4龄试割法”和“有性系第一割年产量法”的准确率接近,但“叶脉胶法”比后两种方法可分别提早3年,7年进行预测(周钟毓等,1986)。在叶脉性状上,有研究认为,叶脉角是一个遗传力较高的性状。1962年扬岗比刚果农业研究所橡胶系H. Amand研究指出:实生树叶脉检定角与其无性后代的平均产量之间的相关系数为-0.5,高产品系选中率可达70%。福建省热作研究所橡胶育种组分别以22个熟态无性系、49个幼态无性系和36个有性系为研究材料,分析无性系叶脉检定角性状与产量关系、亲本无性系叶脉检定角性状在什种一代群体中的遗传及其与产量关系及幼龄母树叶脉检定角性状在其幼态无性系群体中的遗传。结果显示,橡胶树叶脉检定角性状属可遗传的性状,它与产量性状具有遗传相关性。叶脉检定角性状好的无性系和有性个体中约有70%属高产型,30%属低产型;性状差的约有70%属低产型,30%属高产型。母本无性系叶脉检定角性状对杂种一代群体的影响比父本深刻。母树叶脉检定角性状在其无性后代群体中亦可遗传,但传递力不尽相同。叶脉检定角性状可作为预测无性系个体产量指标,准确率高(何忠春等,1981)。次年,何春忠又通过对12个杂交组合与其8个亲本无性系间叶脉检定角性状的相关分析,认为用偏相关系数可真实地反映它们间的相关性。F与父、母本叶脉检定角性状间的相关均具三种情况,均未出现负相关,但比例很不相同。以天任31-45GT1RRIM600为母本,同用PR107作父本的杂交组合其叶脉检定角性状与母本相关均未达到显著,而与父本相关均达显著或极显著,间接论证PR107作杂交父本具有较好的产量遗传力(何忠春,1982)。
 
1.2.2.2 细胞学标记
细胞学标记主要包括染色体核型和带型的分析。染色体的核型指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无等,可以反映出染色体的缺失、重复、倒位和易位等变异,而带型则指G带、C带、N带分析等,反映的是常染色质和异染色质的分布和差异,这种分布和差异可以通过特殊染色显带后的染色体带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等来表示(SithichokeTangphatsornruang et al., 2011)。染色体数量上的遗传多样性指整倍性(多倍体)和非整倍性(缺体、单体、三体等)的变异。一个物种的染色体数目、形态及行为是相对稳定的,通常被作为标记来标定基因所在的染色体及在染色体上的相对位置,染色体是基因的携带者,是遗传物质的载体,染色体变异是遗传变异的重要原因。但是由于许多染色体变异常伴随对生物有害的表型效应,加上细胞学标记材料难以培养,故其在遗传作图上的应用受到限制(Bohn MM, Khairallha D. 1996; 谢皓, 2000)
而在橡胶树早期预测用的最多的细胞学标记为“乳管”,包括初生乳管及次生乳管,但效果最好为标记胁迫后产生的密集次生乳管。乳管是橡胶树合成和贮存天然橡胶的组织, Gens认为乳管列数与产量的相关性是任何一种性状与产量的相关所不能比拟的(Jan G. de Gens,1973)。国外多人研究认为乳管列数和树围是决定苗期幼树产量最重要结构特性(Bobilioff,W,1950; Larue,C.D.,1926; Taylor,1926)。在乳管直径与产量方面,J. B. Gomes认为品系间乳管直径差异显著,且与排胶速率和产量正相关,而Narayanan等人结论则刚好相反(J. B. Gomes etal 1980Narayanan etal 1974)。在筛管直径与产量方面,D. M. Fernando等人研究认为筛选直径与产量之间显著挣相关,并据此培育出高产品系RRIM703D. M. Fernando etal1970J. B. Gomez1982)。在我国上世纪周钟毓团队研究认为4龄以前的乳管数量与成龄树产量相关不密切,4龄以后(4)的乳管数量可作为预测成龄期产胶潜力的指标之一(周钟毓等,19761991,1994)。后人研究认为刺检预测法之所以不准在于其检测的部位在植株的茎干,但12-18个月龄的茎干中次生乳管分化较少,初生乳管还占相当大的比重。而我国的试割法较准且随着预测树龄的增大而越发准确,这显然与次生乳管所占的比重越来越大有关(Hao B.Z.etal ,1985,1990,1996,2000,2004; J.B.Gomez etal ,1986-1987;田维敏,2010;张治礼,1996)。因此与天然橡胶产量密切相关的乳管应当是指树干树皮中的次生乳管,通过机械损伤诱导3蓬以上苗龄萌条产生次生乳管并据此预测亚马逊野生种质和魏克汉种质的次生乳管分化能力进而预测株系产量的方法具有很好的效果及理论依据(田维敏,2008)。
另气孔密度也为生长量的一个有效标记,周钟毓等曾对1龄苗应用“气孔密度法”来鉴定矮生性(1994)。
1.2.2.3 生化标记
生化标记主要包括贮藏蛋白、同工酶和等位酶标记(潘鼎元等, 1995; 张春晓等, 1998; 张含国等, 2000; 宋志文等, 2001)。同工酶标记的遗传多样性显示在蛋白水平上,在植物器官中普遍存在,属单基因控制(Koehn RK, Hilbish TJ; 1987)。由于共显性的特性,可区分杂合、纯合和隐性基因,检测所需材料少并且操作起来非常简便,用种子或在幼苗期就可以进行早期检测,其表现稳定,受环境的影响小,多态性比形态标记和细胞学标记都丰富。同工酶主要以上优点使得同工酶标记广泛应用在遗传多样性研究、遗传图谱构建、物种起源进化及动植物育种等领域(Kadow D et al.,2012;Muhamad N et al.,2012; Lam KL et al.,2012; Eliathe EA et al.,2012; Chow KS et al.,2012)。常用的同工酶有酯酶、过氧化氢酶、细胞色素氧化酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、过氧化物酶、超氧物歧化酶和天冬氨酸转氨酶等。但由于同工酶仅在特定组织和特定时期表达,只分布在染色体组的部分染色体上,位点数少,因此应用上受到了很大的限制。
在橡胶领域,目前研究的标记有叶片光合产量潜力、胶乳生理、橡胶转移酶活性及IAA激素含量及不同激素比例等。其中Sinclair等(2004)认为叶片光合速率、Rubisco含量和活性三者共同决定产量。因此,提高作物光合作用潜力最重要因素为CO2吸收、RuBP再生速率、Rubisco酶数量、活性和经济产量(收获指数)的高低(Parry et al., 2011)Ahmad等(2009)测定了一系列产量存在广泛变异的橡胶树品种(种质)的光合参数,包括光饱和光合效率(Psat)、气孔导度(SC)、蒸腾速率(TR)、叶肉细胞导度(MCond)和瞬时水分利用率(WUEg)。结果表明,产量与Psat, SC, TRMCond正相关。Psat可以解释34%的产量差异。若增加一个自变量-潜在气孔导度指数(即气孔频度和气孔复合体长度平方的乘积,PCI),则对产量的预测力即可增加55%。只采用Psat一个参数鉴定高产品种的准确率为63%,误选率只有17%。而同时采用PsatPCI两个参数则可以鉴定出所有的高产品种。作者认为将PsatPCI两个参数作为一个共同指标,可以作为橡胶树苗圃阶段产量早期预测的直接标准。橡胶树品种的出现和橡胶树品种间割胶后树干部位碳水化合物含量的变化差异将极大地推动橡胶树光合潜力研究(Silpi et al., 2007Salimon J et al.,2012)。热科院研究证明胶木兼优品种的光合速率和羧化效率高于基准品种(王纪坤等,2010)。基准品种PR107在不同的割制条件下,光合活性保持不变(蒋菊生等,2005)。这是因为割胶收集胶乳消耗的部分光合产物主要来自树干碳水化合物含量降低(Silpi et al., 2007; Chantuma et al., 2009)。库动力不足、蔗糖向乳管运输受限(Tang et al., 2010; Dusotoit-Coucaud et al., 2009)等原因导致了橡胶树叶片没有达到最大的光合产量潜力。以光合产量潜力为直接标记的早期选择技术可以有效缩短育种周期,提高品种选择效率。
在胶乳生理参数方面,研究认为橡胶树胶乳中不稳定高能磷含量及2-14C醋酸酯的橡胶合成率与干胶产量之间存在着高度相关关系(多扎克和林琼平, 1966)。陈守才等(1994; 1996)的研究表明,橡胶转移酶活性与橡胶产量正相关,橡胶转移酶可以作为橡胶树产胶能力的重要指标,对橡胶树产量进行早期预测。Cairo等(2009)研究了成龄橡胶树无性系RRIM 600GT 1FX 2261Rubisco、蔗糖合成和水解酶活性与橡胶产量的关系,发现Rubisco、酸性和中性转化酶的活性可能与橡胶产量有关。转化酶与橡胶产量的相关性之前在Mesquita等(2006)的研究中也曾获得证明。黄德宝等(2010)测定了橡胶树三个品种,热研 8-79、热研 7-33-97 PR107的生理生化参数及胶乳产量。这些生理生化参数包括胶乳总固形物、蔗糖、硫醇和无机磷含量,以及蔗糖转化酶活性。发现蔗糖转化酶活性与胶乳产量显著正相关,其他生理指标与胶乳产量的相关性不显著。在胶乳中特定激素含量方面,曹建华等(2009)等发现胶乳中IAAiPA含量及IAA/iPA比值与干胶产量具有一定正相关关系,但相关性不显著。
 
1.2.2.4 分子标记
分子标记以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础,是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与以上三种标记相比,DNA分子标记具有特殊的优点:标记数量丰富,几乎遍及整个基因组;无表型效应,不受季节、环境条件的限制,在生物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析;多态性高,自然存在着许多等位变异;与不良性状无连锁,表现为中性,不影响目标性状的表达;多数分子标记为共显性,故能够鉴定出纯合基因型和杂合基因型,对隐性性状的选择十分便利,提供较完整的遗传信息;检测手段迅速、简单。随着分子生物学技术的发展,得到应用的DNA分子标记已有数十种,主要有:RFLPRAPDAFLPSSRSCARSTSSSCPISSRSNP等等,已广泛应用于物种亲缘关系鉴别、遗传育种、基因库构建、基因组作图、基因定位、基因克隆等方面(张德水, 陈受宜. 1998; 张海英等, 2003; 康俊梅等, 2005; 焦仁海等, 2006; Landel ES, Botistein EW. 1989; Melchinger AE et al., 1990; Staub JE, Serquen FC. 1996Quek SP et al.,2010, Shaheen et al.,2010, Yasmin G et al.,2010)
 
1.2.2.4.1 SSR标记
SSR标记又称为微卫星标记,简单序列长度多态性或短串联重复标记,最早是在人类基因组中被发现的,它分散于所有染色体及各染色体区段(Litt M, Luty JA. 1989),以后发现在所有真核生物基因组中都广泛分布着重复序列(Jarne P et al., 1996),一个微卫星长度一般小于100bp,由2-6bp的重复单位串联重复而成,重复次数一般为10-50次。在基因组的不同位置都有同一类微卫星DNA的分布(Tautz D, Renz M. 1984; Gupta RK et al., 1996; Tóth G et al., 2000)。根据SSR重复单元的排列方式,可分为完全型、不完全型和复合型。根据重复单元碱基的多少可分为:单核苷酸重复(mononucleotide repeatsMNRs),如(A/T)n(C/G)n;二核苷酸重复(dinucleotide repeatsDNRs),如(AT/TA)n(CT/GA)n;三核苷酸重复(trinucleotide repeats TNRs)如(ATG/TAC)n;四核苷酸重复(tetranucleotide repeats TTNRs),如(ATCG/TAGA)n,五核苷酸重复(pentanucleotide repeatsPNRs)如(CCGAT/GGCTAn;六核苷酸重复(hexanucleotide repeatsHNRs),如(ACCAGC/TGGTCGn。截止目前报道来看,在大多数植物中二、三核苷酸重复占主要地位,比如在拟南芥、小麦、水稻、玉米、大豆(Cardle L et al., 2000)、甘蔗、葡萄(Cordeiro GM et al., 2001)、大麦(Thiel T et al., 2003)和柑橘(Chen CX et al., 2006)中以三核苷酸重复为主;而猕猴桃(Fraser LG et al., 2004)、杏树和桃树(Jung S et al., 2005)、咖啡(Aggarwal RK et al., 2007)中则是二核苷酸重复占主导,核基因组中的SSR含量远远高于细胞质基因组中的SSR含量,少数几种植物的叶绿体基因组中存在(AT/TA)n(Powell W et al., 1995; Powell W et al., 1996)Morgante (Morgante M et al., 2000)认为,植物基因组中的SSR含量在基因组转录区SSR含量相对稳定,而与基因组和基因组中的重复序列比例成负相关。各种重复类型的SSR在基因组的不同区域,其分布是不相同的(Wang Z et al., 1994; Smulders MJM et al., 1997)
SSR通常被认为是中性DNA标记,但是随着研究的深入进展,SSR被证明具有实质的功能(Hamada H et al., 1984; Swallow DM et al., 1987; Lu Q et al., 1993; Gupta RK et al., 1996; Li YC et al., 2002)。这些功能主要包括:SSR区域可能是重组的热点区域;位于染色体末端的SSR可保护染色体末端避免降解、融合及基因功能的丢失,维持染色体的完整性,;存在于结构基因转录区的4-6碱基SSR具有编码氨基酸的功能;部分SSR可产生转录起始复合物或活化染色体的功能;SSR可能影响DNA复制,影响控制细胞循环的酶;位于启动子区域时会影响基因的活性,即使位于内含子区域的SSR仍然能够影响基因转录,而有些基因只能在SSR的特定重复次数下表达;很多研究显示SSR能够影响基因的翻译,而人类的很多疾病及遗传失调与SSR的不稳定性有关。
生物进化过程中发生的变异中,位于非编码区的突变多为中性突变,对生物生长发育不会产生太大的影响,而SSR多存在于这些区域,从而使变异得以保存,受选择的影响较小。基因组SSR的丰度和各种功能与效应都与它们的突变率有关,与编码基因位点上的点突变率相比,高很多。目前有两种机制可以解释这种高突变率,一是DNA复制中的滑动突变(Tachida H, Iizuka M. 1992),二是DNA链间的重组(Harding RM et al., 1992),在两种机制的效率推测与环境条件中,有很多因素影响SSR位点的突变率,如重复位点、重复次数、染色体位置、临近DNAGC含量、细胞分裂(有丝分裂和减数分裂)、性别和基因型(即MMR基因的突变)。
SSR的变异表现为:SSR序列的结构和长度,重复次数较多的SSR倾向于有更多的多态性,更大的变异(Weber JL. 1990; Goldstein DB, Clark AG. 1995; Innan H et al., 1997; MD Schug. 1998),突变率随其长度的增加而增加(Goldstein DB, Clark AG. 1995; Innan H et al., 1997; MD Schug. 1998)Smith(1997)通过对核苷酸重复类型的研究提出,二核苷酸重复类型的多态性最高,但不足之处是其扩增产物有拖尾,对结果的准确统计有影响,而三核苷酸重复则比二核苷酸的拖尾较小,比二核苷酸更有前途的SSR;来源于ESTSSR比基因组的SSR有更好的保守性,研究证明,基因组来源的二核苷酸重复类型中(GA)n突变率更高,而三核苷酸重复类型中来源于ESTGC含量高重复其突变率最低(Cho YG et al., 2000);受选择压力的影响,重复序列区域的SSR变异率高于非重复序列区域的SSR,而外显子或开放阅读框的SSR的多态性没有5’3’ UTR和内含子中的SSR多态性高(Cho YG et al., 2000)
SSR标记虽然开发程序复杂、工作量大,成本高,但其共显性、变异频率高、分布广泛、实验中DNA的用量少、操作简便而且重复性较好(刘榜等, 1997; Gupta PK, Varshney RK. 2000)的优点明显,特别是随着ESTs数据量呈指数级的增长,有效利用EST数据库,能大幅度地降低开发成本,因此,SSR标记成为一种更适合和经济有效的分子标记,而广泛地应用于遗传多样性分析(Hokanson SC et al., 1998; Barcaccia G et al., 2003; Song ZP et al., 2003; Tams SH et al., 2004; Folkertsma RT et al., 2005; Hasan M et al., 2006; Fu YB et al., 2006; Wang KJ, Takahata Y. 2007)、品种鉴定(Akag H et al., 1997; William M et al., 1997; Russell JR.1997)、种质资源保存(L´opez-Ses´e1 AI et al., 2002; Fu YB et al., 2006; Wang ML et al., 2006; Cruz VMV et al., 2007)、杂种优势利用(吴卫等, 2002; Zhebentyayeva TN et al., 2003)、遗传作图(Holton1 TA et al., 2002; Adam-Blondon AF et al., 2004; Chagné D et al., 2004; Graham J et al., 2004; Torada A et al., 2006; R. K. Varshney et al., 2006; Hirata M et al., 2006; Okogbenin E et al., 2006Zhang Y et al., 2007; Dondini L et al., 2007; Varshney RK et al., 2007; Hearnden PR et al., 2007)、基因定位(许占有等, 1999; 刘保中等, 2002)QTL定位及辅助选择(McCouch SR et al., 1997;Jakkula LR et al., 1998; Wang T et al., 1998; Wang BH et al., 2006 Li DJ et al.,2012)等方面。
1.2.2.4.2 AFLP标记
扩增片段长度多态性amplified fragment length polymorphismAFLP1992年由ZbaeuaVos发明的,又叫SFRA(Selective restrictionfragment amplification, 通过对限制性酶切片段的选择扩增来检测DNA片段长度多态性,AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点及紧随位点后的选择性碱基变异。AFLP技术的基本反应程序主要包括高质量DNA模板制备,酶切和接头连接、酶切片段预扩增和选择性扩增及凝胶电泳分析等5个步骤。DNA酶切片段长度的多态性是通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来实现的,首先用限制性内切酶将基因组DNA切割成大小不等的片段,每个片段两端带有相应的粘性末端,用人工接头连接并将与其有互补末端的片段连接起来,形成带接头的特异片段,用于后续PCR反应的模板。选用5端与接头和酶切位点序列互补的引物,在3端的酶切位点后添加1-3个选择性碱基,PCR反应中,只有这些片段能够被扩增,最后用变性聚丙烯酞凝胶电泳来分离这些片段。AFLP技术结合了限制性酶切与PCR技术,具有PCR反应的高效性和RFLP的可靠性,一个反应内可检测到5100条不等的大量限制性目的片段。
AFLP技术是设计了针对某种限制内切酶的通用接头( Adapter)以及可与接头序列的限制性酶切位点的序列配对的专用引物,揭示的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。AFLP技术的关键步骤,一是模板DNA被限制性内切酶切割后与AFLP寡聚核昔酸接头进行连接,二是选用PCR技术,选择性地扩增限制性目的序列,三是在5~6%的变性聚丙烯酞胺凝胶上分离扩增产物,然后用银染法等方法来检测产物。AFLP技术分析时所用的两种限制性内切酶酶,一种为常用切割酶,另一种是罕见切割酶,常用切割酶能切割基因组DNA而产生较小的DNA片段,是多切点酶,罕见切割酶,如Msel,是切点数较少的酶,目的是减少扩增片段的量,形成大小不等的随机限制性片段,双酶切后,用特定的接头(Adapter)与限制性酶切DNA片段的两端连接,使这些片段形成带接头的特异片段,根据接头序列和限制位点临近区域的碱基序列,设计一系列3'末端含数个随机变化的选择性碱基的引物进行特异性条件扩增,PCR扩增与引物3'末端选择性碱基相匹配的片段(Vos P et al., 1995)。可选用的限制性内切酶和碱基的种类、数目非常多,从理论上来讲,组合后具有无限多的标记数目供选择。接头和引物由人工合成,在DNA序列信息未知的前提下,实现对酶切片段的PCR扩增。扩增条带呈现多态性的原因是由于不同基因组DNA中因突变引起限制位点的数量发生改变或两个限制位点之间的区域内发生碱基插入、片段消失或顺序重排(Vos P et al., 1995)AFLP技术成功的关键是DNA充分的酶切,这就对DNA模板的质量提出了较高的要求,在操作过程中,应避免DNA的污染和抑制物质存在。采用两步法扩增,先用单选择碱基的引物对连接产物进行预扩增,再用稀释后的预扩增产物进行选择性扩增。AFLP扩增产物的量由3末端的核苷酸数目所决定,因此在选择AFLP引物时,应根据基因组DNA的大小确定引物末端所需的选择性核苷酸数目。
1.3 基于遗传标记遗传图谱构建QTL定位
遗传图谱也称为连锁图谱,遗传图谱的构建是基因组研究的基础性工作,一直以来是人们研究的热点内容(贾继增1996 ; Livia Moura Souza, et al., 2011; KANOKPORN Triwitayakorn et al., 2011; Mantello CC,2012),可为基因定位、克隆及基因组结构与功能的研究奠定基础。在DNA分子标记技术出现以前,利用的遗传标记是易于识别的质量性状,高等动植物主要是叶色、花色、果实颜色、植株高矮、雄性不育及抗病性等生物学性状作为形态标记,而微生物中主要是营养缺陷型。形态标记用两点测验,三点测验来判别性状间的连锁关系,筛选排序后,将不同群体所构建的连锁图通过相同的性状合并,形成一张较为完整的遗传图谱。由于形态性状数量有限,有时不同的性状分布于不同的群体,每次定位的基因数目少,因此,构建一张经典的遗传图谱往往耗时较长。自从1980Bostein首次提出用RFLP作为遗传标记构建连锁图的构想,并构建了人的第一张RFLP图谱之后,DNA分子标记技术已经厂泛地应用于其它动植物遗传图谱的构建中。水稻、玉米和番茄等作物已成功构建较精密的经典遗传图谱并定位了数量较多的基因。
利用DNA分子标记构建连锁图谱,在原理上与传统遗传图谱的构建相似,首先是建立适当的作图群体,合适的作图群体是成功构建遗传图谱的基础,其次是选择适合作图的DNA分子标记,第三是分析确定作图群体中个体或品系的基因型,最后对标记基因型进行连锁分析,构建连锁群体。
一般来说,林木个体高大,且多为常年异交植物,遗传背景高度杂合等特性决定了林木遗传学相对于一年生植物和其它经济农作物而言,研究相对落后。
1.3.1 林木遗传图谱研究现状及存在问题
林木遗传图谱构建起步较晚,其研究工作远远落后于其他植物物种。有些树种有自交不亲和或近交衰退现象,因此象近交物种那样利用近交系所产生的分裂群体进行QTLs定位是不可能的。林木遗传图谱的构建有其重要的理论价值和应用价值分子标记的出现和应用促成了高密度遗传图谱的建立和发展遗传图谱的建立使人们可以借助图谱上的分子标记对林木的抗性等进行早期测定对目标基因进行定位和分离及进行分子标记辅助选择(张春晓等., 1998)
首例林木遗传图谱建立于1981年,由Conkle(Conkle MT., 1981)利用43个同工酶标记对6种针叶树种进行的遗传图谱研究,随着近些年生化标记及DNA分子标记技术的发展,林木遗传图谱构建作图策略的提出,图谱构建研究逐年深入(Tulsieram LK., 1992; Grattapaglia D, Sederoff R. 1994)。云杉属,红豆杉属,落叶松属,柑属,李属,可可属,椰子属及其它一些林木树种已成功构建了遗传图谱(徐云碧等, 1994; 尹佟明等, 1999; Tulsieram LK., 1992;Jarrell DC et al., 1992; Nelson CD et al., 1993; Liu Z, Furnier GR. 1993; Binelli G, Bucci G. 1994; Groover A et al., 1994; Devey ME et al., 1994; Chaparro JX et al., 1994; Moran GF et al., 1994; Vaillancourt RE et al., 1994; Bradshaw HD et al., 1994; Yazdani R et al., 1995; Plomion C et al., 1995; Kubisiak TL et al., 1995; Gocmen B et al., 1996; Devey ME et al., 1996; Grattapaglia D et al., 1996; Yin TM et al., 1997; Echt CS, Nelson CD.1997; Kijas JMH et al., 1997; Jermstad KD et al., 1998; Paglia GP et al., 1998; Brondani RPV et al., 1998; Barreneche T et al., 1998; Remington DL et al., 1999; Sewell MM et al., 1999; Costa P et al., 1999; Lespinasse D et al., 2000; Arcrade A et al., 2000; Nikaido AM et al., 2000; Kondo T et al., 2000; Frewen BE et al., 2000; Herrán A et al., 2000; Billotte N et al., 2000; Brown GR et al., 2001; Cervera MT et al., 2001; Lashermes P et al., 2001; Yin TM et al., 2002; Brondani RPV et al., 2002; Wu RL, Ma CX. 2002; Yin TM et al., 2002; Venkatachalam P et al., 2002; Yin TM et al., 2004; Pugh T et al., 2004; Kim YY et al., 2005; Okogbenin E et al., 2006)
早期构建的林木遗传图谱主要是RAPD(Thomas K Uthup et al., 2011)AFLP标记且密度不高标记类型也不多。近十年来,SSRESTSNP已作为分子标记用于林木遗传图谱的构建,在农作物上已有众多物种利用从EST开发的SSRSNP标记建立了高密度的遗传图谱。随着分子标记技术和作图策略的进一步发展,林木遗传连锁作图进入了迅速发展的阶段。主要代表树种当属杨树、按树、松树和其他针叶树种,期间包括许多果树在内的经济林种也开始了广泛的遗传作图研究(尹佟明等, 1999)。利用遗传图谱和分子标记技术,构建高密度的遗传图谱及对目的基因进行定位,使林木育种从简单的表型选择发展到通过基因型选择,利用遗传图谱和QTL定位进行标记辅助选择,有效地提高了育种效率(王军晖,顾万春. 2000)
   近年来发表的林木遗传连锁图对全基因组的覆盖率不断增加连锁群构建日趋完善,标记种类和数目不断增加连锁图标记间的平均距离逐渐减少,这些因素都利于基因的精细定位和基因克隆。杨树是林木遗传育种的模式植物,其构建遗传图谱的研究比较深入。世界上第一张杨树遗传图谱由美国Minnesota大学的LiuFurnier(1993),以美洲山杨为材料,利用RFLP和等位酶标记构建的,该图谱由14个连锁群组成,覆盖基因组664 cM,由54RFLP标记和3个等位酶标记构成。Bradshaw(1994)利用232RFLP 标记和111RAPD标记构建了毛果杨×美洲黑杨的遗传连锁图覆盖基因组约1527.3cM19个连锁群组成(尹佟明等, 2000)
林木遗传图谱构建的另一个重要方面就是多个数量性状位点(QTL)定位到染色体的上并计算不同QTL 之间的互助关系和每一QTL对表型的贡献率(解释表型的变异程度)以及各个相对QTL 间的加性效应、显性效应和隐性效应等。Bradshaw(1994)构建的杨树遗传图谱对树高、材积、胸径和分枝角等重要数量性状的QTLs 进行定位并对各单基因的作用效应和控制数量性状的多基因数等进行了研究。Nelson(1993)则利用湿地松遗传图谱进行抗松锈病QTLs 的定位及评估
当前林木遗传图谱主要存在着以下三个方面的问题,一是作图群体中个体的数量有限。林木由于树体高大,群体中个体数量的建成受到限制,而图谱上标记数量的多少不能作为衡量图谱质量的标准(Zamir D, Tadmor Y. 1986),相对较大的作图群体有利于缩短染色体上标记之间的相对距离和相近标记之间的位置估计精度[98]。从随机分离结果辨别的最大图距和两个标记间检测到重组的最小图距由作图群体的样本容量的大小所决定。如欲将标记进行紧密定位,同时发现更为松弛的连锁,则需要大的群体,可以检测到更小的重组图距,可以辨别的最大图距就会越大。目前已发表的文章中,林木遗传图谱构建所用的群体一般都在100个单株左右(徐云碧, 朱立. 1994),当前林木遗传图谱构建的一个发展方向就是扩大群体数目提高作图的精度(Frewen BE et al., 2000; Brown GR et al., 2001);第二个问题是,RAPDRFLP等随机标记在林木遗传图谱研究中的应用广泛,但林木育种学家已经开始质疑这一方法的可行性,因为这些随机标记在种内及种间不同群体间的保守性很差,位于非编码区,同源性亦无从得知,存在杂交组合特异性的问题,构建的图谱间无法进行比较和信息传输,限制了林木改良研究中的应用的发展,这也是20世纪九十年代初林木图谱构建经过迅速发展而后又变缓慢的主要原因。此外,对于林木育种来说,QTL在不同组合和不同遗传背景下的稳定性是非常重要的,而具有杂交组合特异性的标记和QTL之间的连锁,可能会随着世代和环境的改变而丢失;最后,目前林木作图方法主要采用近交物种在F2代群体中具有12131的分离位点用于构建图谱(Devey ME et al., 1994; Bradshaw HD et al., 1994; Jermstad KD et al., 1998),而在林木研究中广泛采用的F1群体拟测交作图策略时只利用了11的分离位点(Grattapaglia D, Sederoff R. 1994),构建作图群体所用的标记分离类型,对于一个特定杂交组合来说,除了ab×abF2),或ab×aa(回交),还包含了可能的7种类型,可能有11311111,和121四种分离比,使用近交物种的F2拟测交策略模型将损失具有其它分离比的遗传信息。Wu(Wu RL, Ma CX. 2002)引入的基于EM算法为基础的新算法,考虑到了两个亲本之间的差异,估算4种不同的标记分离类型(异交物种全同胞家系内)之间的重组分数,这种算法在林木等异交物种的遗传作图中将有更好的应用前景。
1.3.2构建遗传图谱的策略
1.3.2.1 连锁图谱构建的理论基础
构建遗传图谱的理论基础是Morgan的遗传连锁理论,基因在同一染色体上的距离近到一定程度时,便不发生重组或重组率极低。遗传图谱是根据亲本及其杂种后代基因的分离情况建立,当基因是连锁时,交换率极低,则可以推断子代的基因型与两亲本基本一致;如果基因间不连锁,分别位于不同的染色体上或位于同一染色体上相距较远时,由在子代中不仅会出现双亲的基因型,也会出现较多数量的重组型基因型。同一条染色体上的遗传距离可以由重组率来推算,重组类型由同源染色体的非姊妹染色单体间发生局部交换而产生,在配子形成过程中,减数分裂细胞中重组型配子所占比例由发生交换的频率所决定,交换频率越高,则重组型配子的比例越大,重组率用r表示,0≤r≤0.50,因交换使两个连锁基因分开的频率同它们在染色体上所处位置的距离成正比,因此,可基因间的遗传图距可以用r来表示,图距单位用厘摩(centi-MorgancM)表示,1 cM表示重组率为1%
1.3.2.2 作图群体
1.3.2.2.1分离群体的类型
分离群体的类型按作图群体稳定性可分为两类:一类是永久性分离群体,如重组自交系、双单倍体群体等;另一类是暂时性分离群体,如F2、回交群体和三交群体等。常见的作图群体有F2代群体或由其产生的F3F4家系,BC1RI群体和DH群体。
作图群体一般为近等基因系或由近等基因系产生的F2或回交群体,林木基因组的自交不亲合现象,使得利用高世代群体构建遗传图谱非常困难。林木由于长期异交,遗传组成高度杂合,F1代中,一些在一个亲本中为杂合位点,在另一亲本中为纯合,利用回交群体模型将其子代中1:1分离位点进行图谱构建,分别得到双亲的遗传图谱(Grattapaglia D, Sederoff R. 1994),又称拟测交策略,现在已广泛应用于林木等多年生植物遗传图谱的构建。
1.3.2.2.2亲本选配
选择作图亲本应考虑的原则是,一是尽量选用纯度高的材料作为亲本,二是选择DNA多态性丰富的材料作为亲本(Staub JK et al., 1996),三是要考虑杂交后代的可育性(Staub JK et al., 1996)
1.3.2.2.3作图群体的大小
大量的作图实践表明,为达到相当的作图精度,所需的群体大小的顺序为FZ>RI>BCI>DH,构建形态性状尤其是数量性状的图谱要比构建DNA标记连锁图谱所需的群体大得多,己发表的林木遗传图谱所用的分离群体大多在100个单株或家系左右(Devey ME et al., 1994; Nikaido AM et al., 2000; Brown GR et al., 2001; Yin TM et al., 2002)。作图群体的大小取决于取决于所用群体的类型,与以下两个方面亦息息相关:一是两个标记间可以检测到重组的最小图距,二是从随机分离结果可以辨别的最大图距(Staub JK et al., 1996)
1.3.2.3分子标记的选择
用于构建图谱的理想DNA分子标记应直接来自于基因表达序列,在不同杂交组合间可以进行信息的传递,呈共显性遗传,实验室操作技术简单,具有重复性等特点。RFLPRAPD等分子标记的特点比较而言,用于构建遗传图谱,进行分子标记辅助育种的最合适的分子标记是SSRs标记和AFLP标记。来源于基因组的SSR标记及来源于ESTSSR标记是近年来研究和构建遗传图谱较多的标记(Stack S et al., 2000; Scott KD et al., 2000; Combes MC et al., 2000; Rovelli P et al., 2000; Cato SA et al., 2001; Kota R et al., 2001; Areshchenkova T et al., 2002; Holton TA et al., 2002; Baruah A et al., 2003; V .Le Guen et al., 2011Pootakham W et al.,2012)SSR不仅可以存在内含子中,也存在于编码区及染色体的其它区域,多态性好(Schlotterer C. 2001),共显性遗传,在群体中常存在大量复等位基因,引物在种内和种间都具有高度保守性,构建不同种或研究群体的遗传图谱也可以利用一套通用的SSR标记。EST来自于基因表达序列,可直接将与目标性状基因相连锁的标记标注在遗传图谱上,可将相同的候选基因定位在不同研究群体的遗传图谱上,来自于DNA编码区的EST,高度保守,在物种水平上的研究具有普遍的意义,还可将直系来源的SSR标记或EST标记作为锚定位点构建同属近缘树种的共祖图谱,进行比较基因组研究(Strauss SH et al., 1992; Paglia GP et al., 1998; Brown GR et al., 2001; Cervera MT et al., 2001)EST标记作为信息纽带可以在不同的种间进行QTLs的稳定性研究,促进其在林木实际育种中的应用。
AFLP技术,即扩增片段长度多态性,是一项新的分子标记技术,它的出现是DNA指纹技术的重大突破。它结合了RFLP的可靠性和RAPD的方便性,多态性丰富,不受环境影响,灵敏度高,用样量小以及快速高效等优点(Vos P et al., 1995; Cervera MT et al., 2001; Schlotterer C. 2001)保证其鉴定的高度准确性,因而在果树等作物指纹图谱应用上被称为效率最高的标记。在林木上广泛应用于品种鉴定、分子遗传图谱的构建、目标基因的定位和克隆等(张德强等, 2003)
1.3.2.4 构建遗传图谱的分析软件
目前构建遗传图谱使用的软件主要有以下几种:
① JoinMap (3.0) StamVanoojien开发,适合BClF2RILs ()单倍体、全同胞等群体,每个连锁组能处理500个标记;
② Mapmaker/exp (3.0) LanderGreenAbrahamson等开发处理的群体类型包,适合BCIF2RILS等全同胞等;
③G-Mendel
④CRI-MAPGreen开发,主要用于构建多位点连锁图谱。
⑤MapQTL (3.0) 功能强大,由VanOojine等开发,可以用3种不同的的方法一一区间MQM和非参数法进行QTL作图处理的类型包括BC1F2RILs()单倍体、全同胞等。
⑥施季森和童春发(2006)开发的全同胞遗传连锁图谱构建软件FsLinkageMAP 1.0
1.3.3 QTL 定位方法研究
植物许多重要的经济性状或农艺性状,如产量、品质、病虫害抗性,抗逆性等,多属于数量性状。数量性状在分离群体中表型呈连续变异,遗传上受多基因控制。数量性状基因座位QTL的定位对育种意义重大,通过寻找与遗传标记和数量性状之间的关系,并将与之相连锁的一个或多个QTL定位。近几年QTL定位在植物上的应用上,抗逆性基因在模式植物上的定位较多。而在橡胶树的基因定位研究中还比较少(陈守才等, 1994Vincent Le Guen et al., 2011)
1.4 分子标记在橡胶树遗传育种上的应用
分子标记技术在橡胶树育种上的研究起步较晚,但发展速度较快。马来西亚橡胶研究所1991年就开始了橡胶分子标记的研究,建立了橡胶树cDNA文库和基因组文库,用来筛选橡胶树RELF的同源探针(Low, F.C.; Gale, M.D. 1991)。张银东等系统研究了橡胶树RAPD技术中引物、镁离子、dNTPTaq酶的浓度等对橡胶树进行RAPD分析中DNA扩增结果的影响,对RAPD反应系统和扩增程序都作了进一步的改进和优化,使其PCR扩增产物均一和稳定更能满足对橡胶树进行大量RAPD分析的要求,为RAPD分子标记技术在橡胶树育种研究中的应用作出基础性的研究工作(张银东等, 1997)。陈守才等1999年利用RAPD体系,在11份抗白粉病品系和11份感病品系的体系中,找到了一个与抗白粉病连锁的RAPD标记OPV-390,用该标记对我国遗传种质资源保存库中20份材料进行验证,结果鉴定出其中的10份具有很高的抗白粉病能力,该条分子标记可为橡胶树抗白粉病筛选的提供重要参考(陈守才等, 1994)
目前分子标记技术在橡胶树中研究内容主要集中在橡胶树的种质资源鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位及辅助选择等方面。
1.4.1 种质资源鉴定
在同一物种内存在大量的多态分子标记,因而使得某一品种具有特异的区别于其它品种的分子标记成为可能。Bease(1993)利用来源于人的微卫星探针,对73个魏克汉种质进行研究,将这73个种质区分开来,并且发现同一品种内,不同植株的DNA指纹是完全相同的。Low(1995)报道,利用RFLP 标记,可以将全同胞品种如热垦178和热垦179、热研7-20-59和热研7-33-97区分开。
1.4.2 遗传多样性分析
对种质资源的遗传多样性进行分析,是育种工作的基础,安泽伟等(2005)14份野生橡胶树种质和国内栽培的37个栽培品种用19RAPD引物和12ISSR引物进行遗传多样性分析,这两种类型的分子标记也是橡胶树进行品种鉴定和遗传多样性研究的有效手段,这些标记可为橡胶树的育种工作起到一定的指导作用,Bease(1994)RFLP标记对栽培种质和野生种质进行遗传多样性分析后表明,栽培种的遗传多样性要低于野生种;
1.4.3 构建遗传图谱
巴西橡胶树的第一张分子标记遗传图谱是Lespinasse(1994)运用拟测交法,利用F1代的106个个体构建而成,该图谱由18个连锁群组成,覆盖基因组2144cM,标记间平均距离为3cM,由388AFLP标记,301RFLP标记、18个微卫星标记构成和10个同工酶标记构成。并且利用这张图谱对南美叶疫病的QTL进行了定位,此后许多橡胶树研究人员利用这张图谱开展了一系列的研究工作(陈守才, 1994; Venkatachalam P et al., 2004; Le Guen V et al., 2003)。罗安定等(2001)等利用AFLP技术建立了共25份橡胶树种质的分别具有高产、抗寒、抗白粉病和耐死皮病等4种性状AFLP图谱。而和丽岗(2007)利用261AFLP标记构建了GT1×IAN873的遗传图谱,该图谱十覆盖的总图距为1455.57 cM,各标记间平均图距为5.58 cM,并进行了茎围、干胶产量及胶乳中一些生理指标的QTL定位。王惠君(2007)113SRAP标记和35SSR标记构建了一张包括18个连锁群,定位61SRAP标记,7SSR标记的分子连锁图谱,该图谱覆盖基因组长度774cM,平均图距为11.38 cM。冯素萍等(2010)以热研88-13×IAN87394F1群体为试材,利用SSR标记,采用FsLinkageMAP 1.0软件,构建了巴西橡胶树热研88-13×IAN873的遗传连锁图谱,包括25个连锁群,覆盖橡胶树基因组2145.14cM,连锁群的平均长度为85.81cM,每个连锁群包含2~16个标记,标记间的平均距离为20.42 cM
1.4.4 基因定位
高密度遗传图谱是进行基因定位的基础,基因定位对于研究基因的相互作用和结构、功能有重要意义,第一张橡胶树的分子标记遗传图谱建立为很多的橡胶树研究学者利用这张图谱开展了基因定位的研究提供便利。Lespinasse(2000)对橡胶树品种PB260RO38及它们的195F1个体进行了抗南美叶疫病的QTL定位,并在RO38的遗传图谱中找到了8个抗性QTL,在PB260中找到1个抗性QTLVenkatachalam(2004)筛选鉴定了一个与矮化相关联的RAPD分子标记,Guen(2003)利用这张遗传图谱进行了抗南美叶疫病的QTL定位,陈守才等(1994)利用这张图谱找到了一个抗白粉病连锁的RAPD标记OPV-390
1.4.5 分子标记辅助选择
橡胶树杂种后代早期选择方法,主要采用叶脉胶法、小叶柄胶法、试割法等[1],而标记辅助选择(Marker assisted selectionMAS)是分子育种的核心技术之一,在不分离基因的情况下对目标基因型进行高效率的选择,减少田间工作量,缩短育种周期,在多基因聚合育种程序中发挥优越性。陈守才等(1994)利用RAPD标记OPV-390对我国20份种质进行检测后发现其中10份具有抗病能力;罗安定等(2001)利用建立的AFLP图谱也找到了一条大小为320bp与抗白粉病连锁的的AFLP标记。Venkatachalam(2004)115个随机引物对橡胶树13个矮种和9个普通品种进行RAPD扩增,找到了1个和矮种橡胶树表型密切相关且只为13个矮种共有的标记。
1.5 研究的目的意义及研究内容
橡胶树是最重要的产胶植物,通过优良品种的应用,人工栽培使单位面积产量提高了约4倍。高产、速生、抗逆性强的品种是各国育种者所追求的目标。研究人工授粉F1群体的生长、产量等性状的遗传性,用于指导育种工作计划,准确的选择授粉亲本材料,获得最大的遗传增益,使得多个优良性状的聚合,提高育种的成功率和选育效率。橡胶树育种周期约30年,如何在早期正确的选择可克服因其非生产期和产量鉴定期较长的缺点,大大的缩短育种周期,提高育种功效和节约成本。借助于分子标记技术构建橡胶树遗传图谱,结合胶乳产量相关的表型性状的QTL定位,便于早期选择,提高育种效率,缩短育种周期。
研究内容:
F1群体的产量干胶、生长等产量性状早期鉴定评价;
F1热研88--13×IAN873群体成龄胶园产量、乳管鉴定
遗传图谱构建
胶乳产量相关的性状QTL定位


1.6 本研究的技术路线

高产杂交群体
速生高产杂交群体
热研88-13×IAN873群体
产量鉴定
生长量鉴定
乳管性状特征
DNA提取
AFLP酶切连接、预扩增、选择性扩增长率
           AFLP酶切连接、预扩增
    选择性扩增长引物筛选
AFLP标记扫描
标记分析
已有SSR标记图谱
构建SSR-AFLP遗传连销图谱
分析比较
聚类分析
筛选优良杂交组合和优良个体
产量相关性状的QTL定位

 


 
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